1.選擇SPE 小柱或濾膜 首先應根據待測物的理化性質和樣品基質, 選擇對待測物有較強保留能力的固定相。若待測物帶負電荷, 可用陰離子交換填料, 反之則用陽離子交換填料。若為中性待測物, 可用反相填料萃取。SPE 小柱或濾膜的大小與規格應視樣品中待測物的濃度大小而定。對於濃度較低的體內樣品, 一般應選用盡量少的固定相填料萃取較大體積的樣品。
2.活化 萃取前先用充滿小柱的溶劑沖洗小柱或用5～ 10ml 溶劑沖洗濾膜。一般可先用甲醇等水
溶性有機溶劑沖洗填料, 因為甲醇能潤濕吸附劑表麵, 並滲透到非極性的矽膠鍵合相中, 使矽膠更容易
3.加樣 一般可采取以下措施: (1) 用0.1mol/L 酸或堿調節, 使pH<3或pH>9, 離心取上層液萃取；(2) 用甲醇、乙腈等沉淀蛋白質後取上清液, 以水或緩沖液稀釋後萃取；(3) 用酸或無機鹽沉淀蛋白質後取上清液, 調節pH 值後萃取；(4) 超聲15min後加入水、緩沖液, 取上清液萃取。尿液樣品中的藥物濃度較高, 加樣前先用水或緩沖液稀釋, 必要時可用酸、堿水解反應破壞藥物與蛋白質的結合, 然後萃取。流速應控制為2～4ml/min, 流速快不利於待測物與固定相結合。
4.清洗填料 反相SPE的清洗溶劑多為水或緩沖液, 可在清洗液中加入少量有機溶劑、無機鹽或調節pH值。加入小柱的清洗液應不超過一個小柱的容積, 而SPE濾膜為5～10ml。
5.洗脫待測物 應選用5～10ml離子強度較弱但能洗下待測物的洗脫溶劑。若需較高靈敏度, 則可先將洗脫液揮乾後, 再用流動相重組殘留物後進樣。體內樣品洗脫後多含有水, 可選用冷凍乾燥法。保留能力較弱的SPE 填料可用小體積、較弱的洗脫液洗下待測物,再用極性較強的HPLC 分析柱如C18柱分析洗脫物。若待測物可電離, 可調節pH 值, 抑制樣品離子化, 以增強待測物在反相SPE 填料中的保留, 洗脫時調節pH值使其離子化並用較弱的溶劑洗脫, 收集洗脫液後再調節pH值使其在HPLC分析中達到最佳分離效果。在洗脫過程中應減慢流速,用兩次小體積洗脫代替一次大體積洗脫, 回收率更高。
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