三聚氰胺檢測試劑盒
使用說明書
（酶聯免疫法）
1 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測奶粉、牛奶、組織、飼料、蛋類、血清等樣本中的三聚氰胺（Melamine，MEL），試劑盒由預包被偶聯抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣本溶液，樣本中的三聚氰胺和酶標板上預包被偶聯抗原競爭抗三聚氰胺抗體，加入酶標記物後，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含三聚氰胺含量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中三聚氰胺的殘留量。
2 技術指標
2.1 試劑盒靈敏度：2ppb(ng/ml)
2.2 反應模式：25℃，30min～15min
2.3 檢測下限：
奶粉……………………………………40ppb
牛奶……………………………………54ppb
牛奶/奶粉（處理法二）………………2ppb
組織（雞/豬/鴨/魚/蝦/肝臟）………4ppb
飼料……………………………………200ppb
蛋類……………………………………40ppb
血清……………………………………8ppb
2.4 交叉反應率：
三聚氰胺………………………………100%
三聚氰酸………………………………60%
三嗪、三嗪二銨………………………<1%
2.5 樣本回收率：
牛奶、奶粉………………………90%±20%
組織………………………………85%±20%
飼料………………………………85%±20%
蛋類………………………………80%±20%
3 試劑盒組成
酶標板……………………………96孔
標準液：各1ml
0ppb、2ppb、6ppb、18ppb、54ppb、162ppb
高標準液（紅蓋）：1ppm…………1ml
酶標記物（紅蓋）…………………5.5ml
抗體工作液（藍蓋）………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
2X復溶液（黃蓋）…………………50ml
說明書………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 機器：酶標機、打印機、均質器 、氮氣吹乾裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：單道20μl-200μl，100μl-1000μl、多道300μl
4.3 試劑：乙腈、氫氧化鈉、濃鹽酸、正己烷、甲醇
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈並使用一次性吸頭，以避免污染乾擾實驗結果。
5.2 配液：
配液1：1M HCl 溶液
取8.6ml濃HCl加去離子水至100ml。
配液2：乙腈-0.1M NaOH溶液
84ml乙腈和16ml 0.1M NaOH混合均勻。
配液3：0.1M NaOH 溶液
稱取0.4g NaOH加去離子水至100ml。
配液4：1M NaOH 溶液
稱取4g NaOH加去離子水至100ml。
配液5：復溶液
將2×復溶液用去離子水2倍稀釋，用於樣本的復溶，復溶液在4℃環境可保存一個月。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 牛奶專用樣本處理方法：
1）取牛奶樣本600μl到2ml的離心管中，加入1ml乙腈，充分振蕩混勻；4000r/min離心5min；
2）取100μl上清液，加入900μl復溶液，混勻；
3）取50 μl用於分析。
牛奶樣本稀釋倍數：27 檢測下限：54ppb
5.3.2 奶粉專用樣本處理方法：
1）稱取2.0±0.05g奶粉樣本至50ml離心管中，加入4ml甲醇，充分振蕩；
2）4000r/min離心10min，取100μl上清液，再加入900μl復溶液，混勻；
3）取50μl用於分析。
奶粉樣本稀釋倍數：20 檢測下限：40ppb
5.3.3 牛奶/奶粉樣本處理方法二：
1）取2ml奶樣或2g奶粉至離心管中；
2）加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min，4000r/min離心10min，取4ml上清液50-60℃下氮氣或空氣流吹至完全乾燥；
3）用1ml正己烷溶解乾燥的殘留物後，再加入1ml復溶液，混合30s，離心去除上層正己烷相；
4）取下層水相50μl用於分析。
樣本稀釋倍數：1 檢測下限：2ppb
5.3.4 組織（雞/豬/鴨/魚/蝦/肝臟）樣本處理方法：
1）取2.0±0.05g均勻組織樣本於50ml離心管中；
2）加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min，4000r/min離心10min，取2ml上清液50-60℃下氮氣或空氣流吹至完全乾燥；
3）用1ml正己烷溶解乾燥的殘留物後，再加入1ml復溶液，混合30s，離心去除上層正己烷相；
4）取下層水相50μl用於分析。
樣本稀釋倍數：2 檢測下限：4ppb
5.3.5 飼料樣本處理方法：
1）將飼料樣品研碎，稱2.0±0.05g研碎的飼料樣品，加入2ml 1M HCl，加入16ml去離子水均質；
2）旋流1min，放振蕩器上振蕩2min；
3）4000r/min離心15min，取出10ml上清液並用1M NaOH將pH值調至6-8。（註：因飼料樣品的不同，加入1M NaOH的量有所差異，根據情況調節，一般加入范圍是0.5ml—1ml之間）
4）4000r/min 離心15min，吸出上清液（如果上清仍然渾濁可提高轉速或用濾紙過濾）；
5）取上清液用復溶液10倍稀釋（取100μl上清液加入900μl復溶液，混合均勻）；
6）取50μl進行分析。
樣本稀釋倍數：100 檢測下限：200ppb
5.3.6 蛋類樣本處理方法：
1）用均質器低速均勻樣本（蛋清、蛋黃或全蛋）；
2）稱取2.0±0.05g均質過的樣本，加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min；（蛋清含蛋白成份高，加入提取液後會形成一團膠狀物，較蛋黃或全蛋難搖勻，此情況為正常現象不影響實驗結果）
3）4000r/min離心10min，取1ml上清液50-60℃下氮氣或空氣流吹至完全乾燥；
4）用1ml正己烷溶解乾燥的殘留物後，再加入1ml復溶液，混合30s，離心去除上層正己烷相；
5）取下層水相用復溶液4倍稀釋（50μl樣本液加150μl復溶液），混合30s；
6）取50μl用於分析。
樣本稀釋倍數：20 檢測下限：40ppb
5.3.7 血清樣本處理方法：
1）取0.5ml血清樣本於50ml離心管中；
2）加入2ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min，4000r/min離心10min，取1ml上清液50-60℃下氮氣或空氣流吹至完全乾燥；
3）用1ml正己烷溶解乾燥的殘留物後，再加入1ml復溶液，混合30s，離心去除上層正己烷相；
4）取下層水相50μl用於分析。
樣本稀釋倍數：4 檢測下限：8ppb
6 酶聯免疫試驗步驟
將所需試劑從4℃冷藏環境中取出，置於室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存於2-8℃。
實驗開始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。
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