機器使用要求

電源電壓  ：220V~±22V  50Hz±0.5Hz

額定功率  ：≤1000W

環境溫度  ：+10℃~+30℃

相對濕度  ：≤85%

機器安放場合不得有腐蝕性氣體及有影響機器正常工作的電場或磁場存在，機器安放工作臺應穩固，不得有振動。保持實驗室有良好的通風環境。

一、簡介

　　液相色譜機根據固定相是液體或是固體，又分為液-液色譜(LLC)及液-固色譜(LSC)。現代液相色譜機由高壓輸液泵、進樣系統、溫度控制系統、色譜柱、檢測器、信號記錄系統等部分組成。與經典液相柱色譜裝置比較，具有高效、快速、靈敏等特點。

　　對高沸點、難氣化合物的混合物通過色譜柱核淋洗劑並以實現分離。應用於生物化學、生物醫學、環境化學、石油化工等部門。

二、工作原理及組成

　　系統由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄機等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統,樣品溶液經進樣器進入流動相,被流動相載入色譜柱(固定相)內,由於樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數,在兩相中作相對運動時,經過反復多次的吸附-解吸的分配過程,各組分在移動速度上產生較大的差別,被分離成單個組分依次從柱內流出,通過檢測器時,樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄機,數據以圖譜形式打印出來高效液相色譜機主要有進樣系統、輸液系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統，下麵將分別敘述其各自的組成與特點。

1．進樣系統

一般采用隔膜註射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作，進樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復性是有益的。

2．輸液系統

　　該系統包括高壓泵、流動相貯存器和梯度機三部分。高壓泵的一般壓強為l．47～4．4X107Pa，流速可調且穩定，當高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴散效應，可加快其在柱中的移動速度，這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存錯和梯度機，可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強度、PH值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質（即使僅有一個基團的差別或是同分異構體）都能獲得有效分離。

3.分離系統

　　該系統包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長度為10～50cm（需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管），內徑為2～5mm，由"優質不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，住內裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質和固定液構成）．固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或矽膠構成，它們都有惰性（如矽膠表麵的矽酸基因基本已除去）、多孔性（孔徑可達1000?）和比表麵積大的特點，加之其表麵經過機械塗漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣），或者用化學法偶聯各種基因（如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體的有機化合物。因此，這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性。例如，在多孔性矽膠表麵偶聯豌豆凝集素（PSA）後，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。

　　另外，固定相基質粒小，柱床極易達到均勻、致密狀態，極易降低渦流擴散效應。基質粒度小，微孔淺，樣品在微孔區內傳質短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據柱效理論分析，基質粒度小，塔板理論數N就越大。這也進一步證明基質粒度小，會提高分辨率的道理。

　　再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調到60C，通過改善傳質速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。

三、液相色譜機的應用

高效液相色譜法隻要求樣品能制成溶液,不受樣品揮發性的限制,流動相可選擇的范圍寬,固定相的種類繁多,因而可以分離熱不穩定和非揮發性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質。與試樣預處理技術相配合,HPLC所達到的高分辨率和高靈敏度,使分離和同時測定性質上十分相近的物質成為可能,能夠分離復雜相體中的微量成分。隨著固定相的發展,有可能在充分保持生化物質活性的條件下完成其分離HPLC成為解決生化分析問題最有前途的方法。由於HPLC具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復利用,流出組分易收集等優點,因而被廣泛應用到生物化學、食品分析、醫藥研究、環境分析、無機分析等各種領域。高效液相色譜機與結構機器的聯用是一個重要的發展方向。液相色譜-質譜連用技術受到普遍重視,如分析氨基甲酸酯農藥和多核芳烴等;液相色譜-紅外光譜連用也發展很快如在環境污染分析測定水中的烴類,海水中的不揮發烴類,使環境污染分析得到新的發展。

四、液相色譜機常見故障處理

1、氣泡溢出

　　流動相內有氣泡,關閉泵,打開泄壓閥,打開purg鍵,清洗脫氣,氣泡不斷從過濾器冒出,進入流動相,無論打開purge鍵幾次,都無法清除不斷產生的氣泡。原因過濾器長期沉浸於乙酸銨等緩沖液內,過濾器內部由於黴菌的生長繁殖,形成菌團,阻塞瞭過濾器,緩沖液難以流暢地通過過濾器,空氣在泵的壓力作用下經過濾器進入流動相。處理過濾器浸泡於5%硝酸溶液中,超聲清洗幾分鐘即可;亦可將過濾器浸泡於5%硝酸溶液中12～36小時,輕輕震蕩幾次,再將過濾器用純水清洗幾次,打開泄壓閥,打開purge鍵清洗脫氣,如仍有氣泡不斷從過濾器冒出,繼續將過濾器浸泡於5%硝酸溶液中,如沒有氣泡不斷從過濾器中冒出,說明過濾器內部的黴菌菌團已被硝酸破壞,流動相可以流暢地通過過濾器。打開泄壓閥,打開泵,流速調至1.0～3.0ml/min,純水沖洗過濾器1小時左右。即可將過濾器清洗乾凈。關閉泄壓閥,純甲醇沖洗半小時即可。

2、柱壓高原因

(1)緩沖液鹽分如(乙酸銨等)沉積於柱內;

(2)樣品污染沉積。處理對於第一種情況先用40～50℃的純水,低速正向沖洗柱子,待柱壓逐漸下降後,相應提高流速沖洗,柱壓大幅度下降後,用常溫純水沖洗,之後用純甲醇沖洗柱子30分鐘;對於第二種情況,由樣品的沉積引起污染的C18柱,和純水反向沖洗柱子,然後換成甲醇沖洗,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定),再用換成甲醇沖洗,然後用純水沖洗,最後甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。

3、既無壓力指示,又無液體流過

(1)泵密封墊圈磨損;

(2)大量氣泡進入泵體。處理對於第一種情況,更換密封墊圈;對於第二種情況,在泵作用的同時,用一個50ml的玻璃針筒在泵的出口處幫助抽出空氣。

4、壓力波動大,流量不穩定

　　原因系統中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物,使得兩者不能密封。處理工作中註意觀察流動相的量,保證不銹鋼濾器沉入儲液器瓶底,避免吸入空氣,流動相要充分脫氣。如為單向閥和閥座之間夾有異物,拆下單向閥,放入盛有丙酮的燒杯用超音波清洗。

5、出峰不佳,峰分叉

(1)色譜柱被污染;

(2)柱頭填料塌陷。處理對於第一種情況,先用純水反向沖洗柱子,然後換成甲醇沖洗,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定),再換成甲醇沖洗,然後用純水沖洗,最後甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。如沖洗後依然出峰不佳,則考慮第二種情況。對於第二種情況,擰開柱頭,檢查柱填料是否硬結或塌陷。去除硬結部分(污染的填料),裝入新填料,滴一滴甲醇,填料下陷,再填,用與柱內徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊,再填平,滴甲醇,再壓緊反復幾次,直至裝滿填平。柱頭用甲醇沖洗乾凈,擦凈柱外壁的填料,擰緊柱頭,用純甲醇沖洗30分鐘以上。

6、峰麵積重復性不佳

(1)進樣閥漏液;

(2)加樣針不到位。

(3)液量不足.

　　處理對於第一種情況更換進樣閥墊圈;對於第二種情況保證加樣針插到底,註射樣品溶液後須快速、平穩地從LOAD狀態轉換到INJECT狀態,以保證進樣量的準確。日常工作中,液相色譜機的保養非常重要,如要註意不要讓空氣進入輸液系統和高壓泵中,儲液器內的溶液如長時間未用應清洗儲液器並更換溶液,每次用完色譜機後緩沖液要用純水沖洗乾凈,防止無機鹽析出或沉積;樣品的前處理也很重要,任何樣品都要盡可能地去除雜質,完全溶解,盡量減少對色譜柱的污染,以延長色譜柱的使用壽命,同時避免註射過濃的樣品溶液,以免殘留液在進樣閥內析出固體引起堵塞;色譜柱作好標記,用於不同分析目的的色譜柱不要混用等。